A Javascript jelenleg le van tiltva a böngészőjében.Ha a javascript le van tiltva, a webhely egyes funkciói nem fognak működni.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Tudományos Osztály, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Katalónia, Spanyolország * Ezeknek a szerzőknek van némi betekintése ebbe a munkába, Equal hozzájárulás háttér: A hialuronsav (HA) egy természetben előforduló poliszacharid, amelyet esztétikai célú dermális töltőanyagok előállításához használnak.Mivel felezési ideje több nap az emberi szövetekben, a HA-alapú dermális töltőanyagokat kémiailag módosították, hogy meghosszabbítsák élettartamukat a szervezetben.A kereskedelemben kapható HA-alapú töltőanyagok leggyakoribb módosítása az 1,4-butándiol-diglicidil-éter (BDDE) használata térhálósító szerként a HA-láncok térhálósítására.A visszamaradó vagy el nem reagált BDDE nem mérgezőnek tekinthető <2 ppm (ppm) értékben;ezért a végső dermális töltőanyagban lévő maradék BDDE mennyiségét számszerűsíteni kell a betegek biztonsága érdekében.Anyagok és módszerek: Ez a tanulmány a BDDE és a HA közötti keresztkötési reakció melléktermékének kimutatását és jellemzését írja le lúgos körülmények között a folyadékkromatográfia és a tömegspektrometria (LC-MS) kombinálásával.Eredmények: Különböző elemzések után megállapították, hogy a HA-BDDE hidrogél fertőtlenítéséhez alkalmazott lúgos körülmények és magas hőmérséklet elősegítette ennek az új mellékterméknek, a „propilénglikolszerű” vegyületnek a kialakulását.Az LC-MS analízis megerősítette, hogy a melléktermék monoizotópos tömege megegyezik a BDDE-vel, más a retenciós ideje (tR), és eltérő az UV-abszorbancia (λ=200 nm).A BDDE-vel ellentétben az LC-MS analízis során azt figyelték meg, hogy azonos mérési körülmények között ennek a mellékterméknek nagyobb a detektálási sebessége 200 nm-en.Következtetés: Ezek az eredmények azt mutatják, hogy ennek az új vegyületnek a szerkezetében nincs epoxid.A vita nyitott a HA-BDDE hidrogél (HA dermális töltőanyag) kereskedelmi célú gyártása során talált új melléktermék kockázatának felmérésére.Kulcsszavak: hialuronsav, HA dermális töltőanyag, térhálósított hialuronsav, BDDE, LC-MS analízis, BDDE melléktermék.
A hialuronsav (HA) alapú töltőanyagok a legelterjedtebb és legnépszerűbb kozmetikai célokra használt dermális töltőanyagok.1 Ez a dermális töltőanyag egy hidrogél, amely általában >95% vízből és 0,5-3% HA-ból áll, ami gélszerű szerkezetet ad.A 2 HA egy poliszacharid és a gerincesek extracelluláris mátrixának fő összetevője.Az egyik összetevő.(1,4)-glükuronsav-β (1,3)-N-acetil-glükózamin (GlcNAc) ismétlődő diszacharid egységekből áll, amelyeket glikozidos kötések kapcsolnak össze.Ez a diszacharid mintázat minden szervezetben azonos.Egyes fehérjealapú töltőanyagokhoz (például a kollagénhez) képest ez a tulajdonság a HA-t rendkívül biokompatibilis molekulává teszi.Ezek a töltőanyagok aminosavszekvencia-specifitást mutathatnak, amelyet a páciens immunrendszere felismerhet.
Bőr töltőanyagként történő alkalmazása esetén a HA fő korlátja a szövetekben történő gyors átalakulása a hialuronidázoknak nevezett enzimek specifikus családjának jelenléte miatt.Eddig a HA szerkezetében számos kémiai módosítást írtak le, amelyek növelik a HA felezési idejét a szövetekben.3 A legtöbb ilyen módosítás a HA-láncok térhálósításával próbálja csökkenteni a hialuronidáz hozzáférését a poliszacharid polimerekhez.Ezért a HA szerkezete és a térhálósító szer közötti hidak és intermolekuláris kovalens kötések miatt a térhálósított HA hidrogél több antienzim bomlásterméket termel, mint a természetes HA.4-6
Eddig a térhálósított HA előállításához használt kémiai térhálósító szerek közé tartozik a metakrilamid, 7 hidrazid, 8 karbodiimid, 9 divinil-szulfon, 1,4-butándiol-diglicidil-éter (BDDE) és poli(etilénglikol)-diglicidil-éter.A 10 ,11 BDDE jelenleg a leggyakrabban használt térhálósító szer.Bár az ilyen típusú hidrogélek biztonságosnak bizonyultak évtizedek óta, a használt térhálósító szerek reaktív reagensek, amelyek citotoxikusak és bizonyos esetekben mutagének is lehetnek.12 Emiatt a végső hidrogélben a maradék tartalomnak magasnak kell lennie.A BDDE akkor tekinthető biztonságosnak, ha a maradék koncentráció kisebb, mint 2 ppm (ppm).4
Számos módszer létezik az alacsony maradék BDDE-koncentráció, a keresztkötési fok és a szubsztitúciós helyzet kimutatására HA hidrogéleken, mint például gázkromatográfia, méretkizárásos kromatográfia tömegspektrometriával (MS), magmágneses rezonancia (NMR) fluoreszcencia mérési módszerek, és Diódasoros csatolású nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC).13-17. Ez a tanulmány egy melléktermék kimutatását és jellemzését írja le a BDDE és HA lúgos körülmények közötti reakciójával előállított végső térhálós HA hidrogélben.HPLC és folyadékkromatográfia-tömegspektrometria (LC-MS analízis).Mivel a BDDE ezen melléktermékének toxicitása nem ismert, javasoljuk, hogy a maradékanyag mennyiségi meghatározását a végtermékben a BDDE-n általában elvégzett módszerhez hasonlóan határozzák meg.
A kapott HA nátriumsó (Shiseido Co., Ltd., Tokió, Japán) molekulatömege ~1 368 000 Da (Laurent-módszer)18, belső viszkozitása 2,20 m3/kg.A térhálósítási reakcióhoz a BDDE-t (≥95%) a Sigma-Aldrich Co.-tól (St. Louis, MO, USA) vásároltuk.A 7,4-es pH-jú foszfáttal pufferolt sóoldatot a Sigma-Aldrich Company-tól vásároltuk.Az LC-MS analízishez használt összes oldószert, acetonitrilt és vizet HPLC minőségű minőségből vásároltuk.A hangyasavat (98%) reagens minőségűként vásárolják.
Minden kísérletet UPLC Acquity rendszeren (Waters, Milford, MA, USA) végeztünk, és egy API 3000 tripla kvadrupól tömegspektrométerhez kötöttük, amely elektrospray ionizációs forrással volt ellátva (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
A térhálósított HA hidrogélek szintézisét úgy kezdtük meg, hogy 198 mg BDDE-t adtunk 10 tömeg%-os nátrium-hialuronát (NaHA) oldathoz 1%-os lúg (nátrium-hidroxid, NaOH) jelenlétében.A reakcióelegy végső BDDE-koncentrációja 9,9 mg/ml (0,049 mM) volt.Ezután a reakcióelegyet alaposan összekeverjük, homogenizáljuk, és 4 órán át 45 °C-on hagyjuk hatni.19 A reakció pH-ját ~12 értéken tartjuk.
Ezt követően a reakcióelegyet vízzel mostuk, és a végső HA-BDDE hidrogélt szűrtük, és PBS-pufferrel hígítottuk, hogy 10-25 mg/ml HA-koncentrációt és 7,4-es végső pH-értéket érjünk el.Az előállított térhálósított HA hidrogélek sterilizálásához ezeket a hidrogéleket autoklávozzuk (120 °C-on 20 percig).A tisztított BDDE-HA hidrogélt az elemzésig 4 °C-on tároljuk.
A térhálósított HA-termékben jelenlévő BDDE elemzéséhez 240 mg-os mintát mértünk le és helyeztünk be a központi lyukba (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; térfogat 0,5 ml), majd 10 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk szobahőmérsékleten. 10 perc.Összesen 20 µl lehúzható folyadékot gyűjtöttünk össze és elemeztünk.
A BDDE standard (Sigma-Aldrich Co) lúgos körülmények között (1%, 0,1% és 0,01% NaOH) történő elemzéséhez, ha a következő feltételek teljesülnek, a folyadékminta 1:10, 1:100 vagy legfeljebb 1:1 000 000 Ha szükséges, használjon MilliQ ionmentesített vizet az elemzéshez.
A térhálósítási reakcióban használt kiindulási anyagok (HA 2%, H2O, 1% NaOH és 0,049 mM BDDE) esetében az ezekből az anyagokból készített mintákból 1 ml-t elemeztünk azonos elemzési körülmények között.
Az iontérképen megjelenő csúcsok specificitásának meghatározásához 10 µl 100 ppb BDDE standard oldatot (Sigma-Aldrich Co) adtunk a 20 µl mintához.Ebben az esetben a standard végső koncentrációja minden mintában 37 ppb.
Először készítsen 11 000 mg/L (11 000 ppm) koncentrációjú BDDE törzsoldatot úgy, hogy 10 μL standard BDDE-t (Sigma-Aldrich Co) 990 μL MilliQ vízzel (sűrűsége 1,1 g/ml) hígít.Ezzel az oldattal készítsen 110 µg/L (110 ppb) BDDE-oldatot köztes standard hígításként.Ezután használja a közbenső BDDE standard hígítót (110 ppb) a standard görbe elkészítéséhez úgy, hogy a közbenső hígítót többször hígítja a kívánt 75, 50, 25, 10 és 1 ppb koncentráció eléréséhez.Amint az 1. ábrán látható, azt találtuk, hogy az 1,1 és 110 ppb közötti BDDE standard görbe jó linearitású (R2>0,99).A standard görbét négy független kísérletben megismételtük.
1. ábra LC-MS analízissel kapott BDDE standard kalibrációs görbe, melyben jó korreláció figyelhető meg (R2>0,99).
Rövidítések: BDDE, 1,4-butándiol-diglicidil-éter;LC-MS, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria.
A térhálósított HA-ban és az alapoldatban lévő BDDE-standardok azonosítására és mennyiségi meghatározására LC-MS analízist alkalmaztunk.
A kromatográfiás elválasztást LUNA 2,5 µm C18(2)-HST oszlopon (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) végeztük, és az analízis során szobahőmérsékleten (25 °C) tartottuk.A mozgó fázis acetonitrilből (A oldószer) és vízből (B oldószer) áll, amely 0,1% hangyasavat tartalmaz.A mobil fázist gradiens elúcióval eluáljuk.A gradiens a következő: 0 perc, 2% A;1 perc, 2% A;6 perc, 98% A;7 perc, 98% A;7,1 perc, 2% A;10 perc, 2% A. A futási idő 10 perc, az injekció térfogata 20 µL.A BDDE retenciós ideje körülbelül 3,48 perc (a kísérletek alapján 3,43-4,14 perc).A mobil fázist 0,25 ml/perc áramlási sebességgel szivattyúzzuk az LC-MS analízishez.
A BDDE elemzéshez és MS-sel történő kvantifikáláshoz az UPLC rendszert (Waters) egy API 3000 tripla kvadrupól tömegspektrométerrel (AB SCIEX) kombinálják, amely elektropermet ionizációs forrással van felszerelve, és az analízis pozitív ion módban (ESI+) történik.
A BDDE-n végzett ionfragmens analízis szerint a legnagyobb intenzitású fragmentum a 129,1 Da-nak megfelelő fragmentum (6. ábra).Ezért a több-ionos megfigyelési módban (MIM) a kvantifikációhoz a BDDE tömegkonverziója (tömeg-töltés arány [m/z]) 203,3/129,1 Da.Az LC-MS elemzéshez teljes letapogatási (FS) és termékion-letapogatási (PIS) módot is használ.
A módszer specifitásának igazolására vakmintát (kezdeti mozgófázis) elemeztünk.A 203,3/129,1 Da tömegkonverziójú vakmintában nem észleltünk jelet.A kísérlet megismételhetőségét illetően 10 standard injekciót 55 ppb-vel (a kalibrációs görbe közepén) elemeztünk, ami 5% alatti maradék szórást (RSD) eredményezett (az adatok nem láthatók).
A maradék BDDE-tartalmat nyolc különböző autoklávozott BDDE térhálósított HA hidrogélben határoztuk meg, négy független kísérletnek megfelelően.Az „Anyagok és módszerek” részben leírtak szerint a számszerűsítést a BDDE standard hígítás regressziós görbéjének átlagértéke alapján értékelik ki, amely megfelel a BDDE 203,3/129,1 Da tömegátmenetnél észlelt egyedi csúcsnak, retencióval. idő 3,43-4,14 perc Nem vár.A 2. ábra a 10 ppb-s BDDE referenciastandard egy példa kromatogramját mutatja.Az 1. táblázat nyolc különböző hidrogél maradék BDDE-tartalmát foglalja össze.Az értéktartomány 1 és 2,46 ppb között van.Ezért a mintában a maradék BDDE-koncentráció emberi felhasználásra elfogadható (<2 ppm).
2. ábra: 10 ppb BDDE referenciastandard (Sigma-Aldrich Co) ionkromatogramja, MS (m/z) átmenet LC-MS analízissel kapott 203,30/129,10 Da (pozitív MRM módban).
Rövidítések: BDDE, 1,4-butándiol-diglicidil-éter;LC-MS, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria;MRM, többszörös reakció monitorozása;MS, tömeg;m/z, tömeg/töltés arány.
Megjegyzés: Az 1-8. minták autoklávozott BDDE térhálósított HA hidrogélek.A hidrogélben lévő BDDE maradék mennyiségét és a BDDE retenciós idejének csúcsát is közöljük.Végül új, eltérő retenciós idővel rendelkező csúcsok létezéséről is beszámolnak.
Rövidítések: BDDE, 1,4-butándiol-diglicidil-éter;HA, hialuronsav;MRM, többszörös reakció monitorozása;tR, retenciós idő;LC-MS, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria;RRT, relatív retenciós idő.
Meglepő módon az LC-MS ionkromatogram elemzése azt mutatta, hogy az összes elemzett autoklávozott térhálósított HA hidrogél minta alapján extra csúcs volt a rövidebb, 2,73-3,29 perces retenciós időnél.Például a 3. ábra egy térhálós HA-minta ionkromatogramját mutatja, ahol egy további csúcs jelenik meg eltérő, körülbelül 2,71 perces retenciós idő mellett.A megfigyelt relatív retenciós időt (RRT) az újonnan megfigyelt csúcs és a BDDE csúcs között 0,79-nek találtuk (1. táblázat).Mivel tudjuk, hogy az újonnan megfigyelt csúcs kevésbé marad meg az LC-MS analízisben használt C18 oszlopban, az új csúcs egy polárisabb vegyületnek felelhet meg, mint a BDDE.
3. ábra: LC-MS-sel nyert térhálós HA hidrogél minta ionkromatogramja (MRM tömegkonverzió 203,3/129,0 Da).
Rövidítések: HA, hialuronsav;LC-MS, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria;MRM, többszörös reakció monitorozása;RRT, relatív retenciós idő;tR, retenciós idő.
Annak kizárására, hogy a megfigyelt új csúcsok a felhasznált nyersanyagokban eredetileg jelenlévő szennyezők lehetnek, ezeket a nyersanyagokat is elemeztük ugyanazzal az LC-MS elemzési módszerrel.Az elemzett kiindulási anyagok közé tartozik a víz, 2% NaHA vízben, 1% NaOH vízben és BDDE ugyanolyan koncentrációban, mint a térhálósítási reakcióban.A felhasznált kiindulási anyag ionkromatogramja nem mutatott vegyületet vagy csúcsot, retenciós ideje megfelel az új megfigyelt csúcsnak.Ez a tény elveti azt a gondolatot, hogy nemcsak a kiindulási anyag tartalmazhat olyan vegyületeket vagy anyagokat, amelyek megzavarhatják az elemzési eljárást, de nincs jele más laboratóriumi termékekkel való esetleges keresztszennyeződésnek.A BDDE és az új csúcsok LC-MS analízise után kapott koncentrációértékek a 2. táblázatban (1-4. minták), az ionkromatogram pedig a 4. ábrán láthatók.
Megjegyzés: Az 1-4. minták az autoklávozott BDDE térhálósított HA hidrogélek előállításához használt nyersanyagoknak felelnek meg.Ezeket a mintákat nem autoklávozták.
Rövidítések: BDDE, 1,4-butándiol-diglicidil-éter;HA, hialuronsav;LC-MS, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria;MRM, többszörös reakció monitorozás.
A 4. ábra a HA és a BDDE térhálósítási reakciójában használt nyersanyag mintájának LC-MS kromatogramjának felel meg.
Megjegyzés: Mindezeket a térhálósítási reakció végrehajtásához használt koncentrációban és arányban mérik.A kromatogramon elemzett nyersanyagok számai a következőknek felelnek meg: (1) víz, (2) 2%-os HA vizes oldat, (3) 1%-os vizes NaOH oldat.Az LC-MS analízist 203,30/129,10 Da tömegkonverzióra végezzük (pozitív MRM módban).
Rövidítések: BDDE, 1,4-butándiol-diglicidil-éter;HA, hialuronsav;LC-MS, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria;MRM, többszörös reakció monitorozás.
Vizsgálták azokat a körülményeket, amelyek új csúcsok kialakulásához vezettek.Annak vizsgálatára, hogy a térhálósított HA hidrogél előállításához alkalmazott reakciókörülmények hogyan befolyásolják a BDDE térhálósító szer reaktivitását, ami új csúcsok (esetleges melléktermékek) kialakulásához vezet, különböző méréseket végeztünk.Ezekben a meghatározásokban a végső BDDE térhálósítót tanulmányoztuk és elemeztük, amelyet különböző koncentrációjú NaOH-val (0%, 1%, 0,1% és 0,01%) kezeltünk vizes közegben, majd autoklávozással vagy anélkül.Az ugyanazon körülmények szimulálására szolgáló bakteriális eljárás megegyezik a térhálósított HA hidrogél előállítására használt módszerrel.Az „Anyagok és módszerek” részben leírtak szerint a minta tömegátalakulását LC-MS-sel 203,30/129,10 Da értékre elemeztük.A BDDE-t és az új csúcs koncentrációját kiszámítjuk, az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. Azokban a mintákban, amelyeket nem autoklávoztak, nem észleltünk új csúcsokat, függetlenül attól, hogy az oldatban NaOH van (1-4. minták, táblázat). 3).Az autoklávozott minták esetében új csúcsok csak NaOH jelenlétében mutathatók ki az oldatban, és úgy tűnik, hogy a csúcs kialakulása az oldat NaOH koncentrációjától függ (5-8. minták, 3. táblázat) (RRT = 0,79).Az 5. ábra egy ionkromatogram példáját mutatja, amely két autoklávozott mintát mutat NAOH jelenlétében vagy hiányában.
Rövidítések: BDDE, 1,4-butándiol-diglicidil-éter;LC-MS, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria;MRM, többszörös reakció monitorozás.
Megjegyzés: A felső kromatogram: A mintát 0,1%-os vizes NaOH-oldattal kezeltük, és autoklávoztuk (120 °C-on 20 percig).Alsó kromatogram: A mintát nem NaOH-val kezeltük, hanem azonos körülmények között autoklávoztuk.A 203,30/129,10 Da tömegkonverziót (pozitív MRM módban) LC-MS-sel elemeztük.
Rövidítések: BDDE, 1,4-butándiol-diglicidil-éter;LC-MS, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria;MRM, többszörös reakció monitorozás.
Minden autoklávozott mintában, NaOH-val vagy anélkül, a BDDE koncentrációja nagymértékben (akár 16,6-szeresére) csökkent (5-8. minták, 2. táblázat).A BDDE-koncentráció csökkenése annak tudható be, hogy magas hőmérsékleten a víz bázisként (nukleofilként) működhet, felnyitva a BDDE epoxidgyűrűjét, így 1,2-diol vegyület keletkezik.Ennek a vegyületnek a monoizotópos minősége eltér a BDDE minőségétől, ezért nem lesz hatással.Az LC-MS 203,30/129,10 Da tömegeltolódást mutatott ki.
Végül ezek a kísérletek azt mutatják, hogy az új csúcsok kialakulása a BDDE, NAOH jelenlététől és az autoklávozási folyamattól függ, de semmi köze a HA-hoz.
A körülbelül 2,71 perces retenciós időnél talált új csúcsot ezután LC-MS-sel jellemeztük.Ebből a célból BDDE-t (9,9 mg/ml) 1%-os vizes NaOH-oldatban inkubáltunk és autoklávoztunk.A 4. táblázatban az új csúcs jellemzőit összehasonlítjuk az ismert BDDE referenciacsúccsal (retenciós idő körülbelül 3,47 perc).A két csúcs ionfragmentációs elemzése alapján megállapítható, hogy a 2,72 perces retenciós idejű csúcs ugyanazokat a fragmentumokat mutatja, mint a BDDE csúcs, de eltérő intenzitással (6. ábra).A 2,72 perces retenciós időnek (PIS) megfelelő csúcs esetében egy intenzívebb csúcsot figyeltek meg a fragmentáció után 147 Da tömegnél.Az ennél a meghatározásnál használt BDDE koncentrációnál (9,9 mg/mL) a kromatográfiás elválasztást követően az ultraibolya spektrumban eltérő abszorbancia módusokat (UV, λ=200 nm) is megfigyeltünk (7. ábra).A 2,71 perces retenciós idejű csúcs még 200 nm-en látható, míg a BDDE csúcs nem figyelhető meg a kromatogramon azonos körülmények között.
4. táblázat: A körülbelül 2,71 perces retenciós idejű új csúcs és a 3,47 perces retenciós idejű BDDE csúcs jellemzése
Megjegyzés: Ezen eredmények eléréséhez LC-MS és HPLC elemzéseket (MRM és PIS) végeztünk a két csúcson.A HPLC elemzéshez 200 nm hullámhosszú UV-detektálást használnak.
Rövidítések: BDDE, 1,4-butándiol-diglicidil-éter;HPLC, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia;LC-MS, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria;MRM, többszörös reakció monitorozása;m/z, tömeg/töltés arány;PIS, termék Ionszkennelés;ultraibolya fény, ultraibolya fény.
Megjegyzés: A tömegfragmenseket LC-MS analízissel (PIS) kapjuk.Felső kromatogram: BDDE standard mintadarabok tömegspektruma.Alsó kromatogram: A detektált új csúcs tömegspektruma (a BDDE-csúccsal társított RRT 0,79).A BDDE-t 1%-os NaOH-oldatban dolgoztuk fel és autoklávoztuk.
Rövidítések: BDDE, 1,4-butándiol-diglicidil-éter;LC-MS, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria;MRM, többszörös reakció monitorozása;PIS, termékion-szkennelés;RRT, relatív retenciós idő.
7. ábra: A 203,30 Da prekurzor ion ionkromatogramja, és (A) az új csúcs 2,71 perces retenciós idejével és (B) a BDDE referencia standard csúcs UV-detektálása 3,46 percnél 200 nm-en.
Az összes előállított térhálósított HA hidrogélnél megfigyelhető volt, hogy az LC-MS kvantifikáció után a maradék BDDE koncentráció <2 ppm volt, de az analízisben egy új, ismeretlen csúcs jelent meg.Ez az új csúcs nem egyezik a BDDE szabvány termékével.A BDDE szabványos termék is ugyanezen a minőségi konverzión (MRM konverzió 203,30/129,10 Da) esett át pozitív MRM módban.Általában más analitikai módszereket, például kromatográfiát használnak határérték-tesztként a BDDE kimutatására hidrogélekben, de a maximális kimutatási határ (LOD) valamivel alacsonyabb, mint 2 ppm.Másrészt eddig az NMR-t és az MS-t használták a HA térhálósodásának és/vagy módosulásának mértékének jellemzésére a térhálósított HA termékek cukoregység-fragmenseiben.Ezeknek a technikáknak soha nem az volt a célja, hogy számszerűsítsék a maradék BDDE-detektálást ilyen alacsony koncentrációk mellett, mint ahogyan ebben a cikkben leírjuk (LC-MS módszerünk LOD = 10 ppb).
Feladás időpontja: 2021-01-01